HBXIP过表达在胃癌预后评估中的作用及

来源：《中华病理学杂志》

作者：朴俊杰，林贞花，刘双萍（吉林省延吉市，长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室;延边大学医学院病理学教研室）李楠，王艺璇（长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室,吉林省延吉市）

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目的：探讨乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白（HBXIP）在胃癌细胞株AGS中的定位及其过表达与胃癌患者临床病理参数及预后的关系。

方法：采用免疫荧光技术检测HBXIP在胃癌细胞株AGS的定位，采用免疫组织化学EnVision法检测HBXIP在97例胃癌组织、41例癌旁非瘤组织和13名正常胃黏膜上皮组织中的表达，并分析HBXIP过表达与胃癌患者病理参数及预后评估之间的关系。

结果：免疫荧光、免疫组织化学结果显示HBXIP主要定位于胃癌细胞的细胞质，免疫组织化学结果显示HBXIP蛋白在胃癌组织中表达阳性率和强阳性率分别为68.0%(66/97)和49.5%(48/97)，显著高于癌旁非瘤组织(48.8%，20/41；36.6%，5/41)和正常胃黏膜上皮组织（2/13，1/13；P值均＜0.05）；卡方检验结果显示，HBXIP表达水平与胃癌患者分化程度、有无淋巴结转移密切相关(P值分別为0.和0.）。Kapkn-Meier生存分析表明，HBXIP高表达胃癌患者总生存期显著低于HBXIP低表达的患者（P=0.）。

结论：HBXIP表达主要定位于细胞质，表达水平与胃癌的发生发展及预后密切相关。HBXIP表达水平可成为预测胃癌患者预后的重要指标。

　　胃癌（gastriccarcinoma）是世界上最常见的恶性性肿瘤之一，其病死率位居所有恶性肿瘤第二位[1]。在我国，每年胃癌死亡率约为30/10万[2]。随着我国人口老龄化，生活环境、饮食习惯的改变，其发病率也呈逐年上升。我国胃癌患者大多数在就诊时已处于进展期，早期胃癌所占比例不足10%[3]。因此，我国胃癌患者早期诊断率低、预后差，治疗困难。据研究，影响胃癌患者预后的因素主要包括肿瘤发生的部位、分化程度、浸润及转移，而上述过程有多种癌基因、抑癌基因参与调节。因此，发现早期诊断、预后评估的有效检测指标及分子靶点已成为提高胃癌患者预后的重要手段。

　　乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白（HepatitisBX-interactingprotein，HBXIP）是一个由个氨基酸组成，相对分子质量约，定位于染色体1p13.3的保守的细胞组成蛋白[4]。HBXIP首次发现于人肝癌细胞株HepG2，并发现其能与乙型肝炎病毒编码蛋白（HBX）的C末端结合，改变乙型肝炎病毒的复制周期[5]。研究表明，HBXIP与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关，如乳腺癌[6]、肝癌[7]、肺癌[8]等。其与胃癌之间的相关尚少见报道。我们旨在应用免疫组织化学法检测HBXIP蛋白在97例胃癌组织、41例癌旁非瘤组织和13名正常胃黏膜上皮组织中的表达情况及其与胃癌临床病理参数之间的关系，并探讨检测HBXIP表达对胃癌患者临床预后评估中的价值。

1.细胞培养：胃腺癌细胞株AGS由延边大学肿瘤研究中心组织库提供。AGS细胞常规培养于DMEM培养液，含10%胎牛血清、链霉素（10mg/L)和青霉素（U/L），于5%CO2、37℃的细胞培养箱中培养，隔2d换液，3-4d传代。

　　2.免疫荧光染色：盖玻片放入培养皿，加入含有-个胃癌AGS细胞的培养基悬液2mL，贴壁后甲醇固定TritonX打孔，3%牛血清白蛋白封闭2h，HBXIP(1：，CellSignaling公司）一抗4℃孵育过夜，Aluxia抗兔（1：0，CellSignaling公司）二抗避光常温孵育2h，抗荧光淬灭封片剂（含DAPI)封片，LeicaTCSSP5Ⅱ激光共聚焦显微镜观察拍摄。

　　3.临床材料：组织标本选自延边大学医学院肿瘤组织库。包括97例胃癌、41例癌旁非瘤组织和13名正常胃黏膜上皮组织标本。本组胃癌患者中男性19例，女性78例；患者年龄22-80岁，其中年龄≤60岁的有68例，＞60岁的29例；依据国际TNM分期标准，Ⅰ-Ⅱ期67例，Ⅲ-Ⅳ期30例；依据分化程度，低分化60例，中分化30例，高分化7例；有淋巴结转移者28例，无淋巴结转移者69例。97例胃癌切除标本中41例含癌旁非瘤组织，41例癌旁非瘤组织中正常胃黏膜组织10例，胃黏膜不典型增生16例，慢性胃炎15例。13名正常肺组织来源于延边大学医学院病理学教研室尸检存档蜡块。对所有97例胃癌患者进行随访，随访患者每3个月均进行电话随访，随访开始于1年4月，结束至年10月，最短随访时间为5个月，最长随访时间为个月。

　　4.免疫组织化学染色：检测试剂盒为Dako公司产品。染色步骤简略为：常规脱蜡、抗原修复，加入一抗HBXIP(1：稀释)4℃孵育过夜；次日滴加二抗，DAB显色，Mayer苏木精对比染色，中性树胶封片。为证明HBXIP蛋白抗体免疫组织化学检测的特异性，实验中应用了鼠IgG代替一抗作为对照，结果为阴性。同时，选择HBXIP蛋白阳性染色的切片，以PBS代替一抗的染色结果为阴性作为结果可信的实验依据。

　　5.免疫组织化学判定标准：HBXIP蛋白表达以在细胞质中出现棕褐色颗粒作为判定阳性染色的标准。结合染色强度，根据阳性细胞数的比例将染色结果分为4级：阳性细胞数0-5%为0级；阳性细胞数6%-25%为1级；阳性细胞数26%-50%为2级；阳性细胞数51%-75%为3级；阳性细胞数＞75%为4级。同时，计算阳性率的方法设定为2种：（1）阳性率：指≥1级的阳性染色（低表达）病例占总病例数的百分数；（2）强阳性率：指2-4级阳性染色（高表达）病例占总病例数的百分数。

　　6.统计学方法：应用SPSS17.0统计学软件，采用X2检验或Fisher精确检验方法，运用Kaplan-Meier和Cox进行生存分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

1.HBXIP在AGS胃癌细胞株中的定位：免疫荧光结果示HBXIP主要表达于AGS胃癌细胞的细胞质。同样，免疫组织化学染色结果示HBXIP主要表达于胃癌组织的细胞质（图1-7)。

　　2.HBXIP在胃癌组织中表达的阳性率和强阳性率分别为68.0%(66/97)和49.5%(48/97)；在癌旁非瘤组织中表达的阳性率和强阳性率分别为48.8%(20/41)和36.6%(15/41)；在正常胃黏膜上皮组织中表达阳性和强阳性比例分别为2/13和1/13。胃癌组织与癌旁非癌组织中HBXIP蛋白的表达与正常胃黏膜上皮组织相比，差异有统计学意义(均P＜0.05，表1)。

图1-3HBXIP在胃癌细胞株AGS中的表达，HBXIP主要定位于AGS胃癌细胞的细胞质；

　　图1DAPI，蓝色荧光；

　　图2HBXIP；

　　图3融合图像；

　　图4-7HBXIP在正常胃黏膜和胃癌组织中的表达EnVision法中倍放大；

　　图4示HBXIP蛋白在正常胃组织中呈阴性表达；

　　图5示HBXIP在旁癌非癌组织中呈弱阳性表达；

　　图6示HBXIP在胃癌组织中呈弱阳性表达；

　　图7示HBXIP在胃癌组织中呈强阳性表达。

表1HBXIP在各组胃组织中的表达

注：a：与正常组织相比，差异具有统计学意义，P＜0.；b；与正常组织相比，差异具有统计学意义，P＜0.05；阳性率：样本染色参数为＋，＋＋和＋＋＋的百分比；强阳性率：样本染色强度为＋＋和＋＋＋的百分率。

　　3.HBXIP过表达与胃癌临床病理特点的关系；HBXIP过表达与胃癌组织分化程度、淋巴结转移有密切关系，但与患者的性别、年龄、肿瘤大小及临床分期无明显相关性。HBXIP在髙分化、中分化和低分化胃癌中的强阳性率分别为71.4%、66.7%和35.0%，差异有统计学意义（P＜0.01）；在有淋巴结转移的胃癌组织中HBXIP强阳性率高达67.9%(19/28),显著高于无淋巴结转移的胃癌组织中的强阳性率(44.9%，31/69；P＜0.05；表2)。

表2HBXIP过表与胃癌临床病理参数之间的关系[例（%）]

4.生存分析：Kaplan-Meier生存分析显示，HBXIP蛋白表达水平对胃癌患者生存期有显著影响。HBXIP高表达胃癌患者的总生存期显著低于HBXIP低表达的胃癌患者的总生存期（P＝0.，图8）

图8Kapkn-Mder统计97例胃癌组织中HBXIP蛋白表达与患者生存期的关系；HBXIP高表达的胃癌患者的总生存时间显著低于HBX1P低表达患者的总生存期。

HBXIP是由HBXIP基因编码的细胞组成型蛋白[4]。HBXIP由于能够与乙肝病毒的HBX蛋白的C末端结合而被命名。HBXIP是一种拥有多种调节作用的蛋白，可通过不一样的分子机制，起到不一样的功能及作用：（1)HBXIP通过与survivin蛋白结合形成复合物，通过抑制pro-aspase-9的激活，抑制细胞凋亡[9]。（2）HBXIP与HBX在细胞进行有丝分裂时，定位于细胞中心体，推测HBXIP参与中心体的复制[10]。（3）HBXIP与NTP依赖的DNA/RNA解旋酶Suv3p蛋白结合，具体作用尚不清楚[11]。(4)HBXIP蛋白可能通过LXRs/SREBP-1c/FAS参与肿瘤细胞的脂类代谢[12]，或通过增加抑癌基因MST1乙酰化降低其蛋白表达，促进肿瘤细胞的增殖与迁移[13]。目前的研究结果显示HBXIP基因在乳腺癌、肝癌、卵巢癌等肿瘤中表现出癌基因的特性，其参与肿瘤发生发展的过程非常复杂，相关研究正在不断深入，这些研究结果为临床肿瘤的诊治提供了越来越多的理论基础。

　　我们通过免疫组织化学及免疫荧光等研究方法证实HBXIP蛋白在胃癌组织及胃癌细胞中主要定位于细胞质。Zhang等[14]研究发现在一般情况下HBXIP蛋白主要定位于乳腺癌细胞的细胞核与细胞质，且ERK1/2可以通过磷酸化c-FosThr()，Thr()，Thr()和Ser()位点调节HBXIP蛋白的入核行为。我们的结果显示HBXIP蛋白主要在细胞质中表达，而在细胞核中的表达非常少见，说明HBXIP在不同肿瘤中的入核行为、主要功能及调节方式可能不尽相同，揭示不同来源的肿瘤中HBXIP的作用机制均不相同。cheng等[15]研究发现HBXIP在乳腺癌中广泛高表达，且与乳腺癌患者TNM分期、淋巴结转移及Ki-67表达密切相关，其结果与本研究组的研究结果一致。我们发现胃癌中HBXIP阳性及强阳性表达率显著高于正常胃黏膜及癌旁非瘤组织，并发现HBXIP表达与胃癌的分化程度、淋巴结转移密切相关。Li等[16]研究发现HBXIP通过调控MEKK2-ERKl/2-Capn4信号通路促进癌细胞丝状伪足的形成，从而增强癌细胞浸润及转移能力。Shi等[17]研究发现HBXIP通过上调FGF4蛋白促进乳腺癌细胞迁移。

　　在本研究中，我们运用Log-rank分析方法发现HBXIP过表达与胃癌患者总生存期密切相关，即HBXIP高表达的患者生存时间显著短于低表达的患者，提示HBXIP高表达可成为胃癌患者不良预后的一个重要分子标志。有学者研究发现，MiR-及MiR-p通过抑制HBXIP表达，降低乳腺癌及肝癌的增殖与迁移，说明HBXIP可作为肿瘤治疗的潜在耙点[18-19]。

　　综上所述，我们发现HBXIP在正常胃黏膜和胃癌中的表达差异情况，证明该蛋白可能参与了胃癌的发生发展过程。我们的研究充实了HBXIP在不同肿瘤组织中表达情况的总结与分析。结合HBXIP表达与胃癌临床生物学特征及预后关系的分析结果，可认为HBXIP有望成为新的肿瘤标志物及潜在的分子治疗靶点，并为胃癌患者预后判定提供指导。尽管在胃癌及乳腺癌中，HBXIP均可作为临床诊断及预后判断的标志物，但作用机制可能不同，作为新发现的癌基因、癌蛋白，HBXIP的功能与作用机制需要进一步深人探讨。

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